Rezultate
Rezultate Cercetare

      Rezumatul Etapei I
      In cadrul etapei I, în cadrul proiectului component 1, coordonat de P2 - INCD Cantacuzino, s-a optimizat metodologia de izolare și s-a elaborat procedura de cultivare a celulelor tumorale primare pornind de la piese tumorale prelevate de la pacienți cu cancer de colon supuși intervențiilor chirurgicale. De asemenea, s-a elaborat procedura de cultivare și s-au optimizat parametrii de testare a liniilor celulare tumorale pentru a fi folosite in experimentele preliminare de prototipare a dispozitivelor.       În cadrul proiectului 2, coordonat de CO - TUIASI, s-a realizat modelarea teoretica a dielectroforezei, realizarea set-up-ului experimental pentru spectroscopia dielectrică, proiectarea platformei cu microelectrozi interdigitați multiplexați, dar și modelarea şi simularea curgerii în sistemul microfluidic utilizând codul numeric comercial ANSYS® FLUENT. Modelarea prezintă comportamentul curgerii unui amestec de sânge cu o soluție de lizare (cu un raport de debite 1:12) in segmentul microfluidic pentru lizarea eritrocitelor și a leucocitelor.
      În cadrul proiectului component 3, coordonat de P3 – UTBv, a fost realizată proiectarea și simularea micromagnetică a dispozitivului magnetoforetic pentru manipularea și concentrarea celulelor de interes marcate magnetic și eliminarea celulelor neviabile. După o analiză a literaturii științifice în domeniu au fost alese structurile magnetice in forma literei „V” care vor permite o captare a celulelor marcate cu nanoparticule magnetice intr-o regiune precis delimitata si separarea lor de celulele nemarcate, care prezinta, de regula, proprietati diamagnetice. Layout-ul acestui sistem magnetoforetic a fost proiectat in cadrul IMT-Bucuresti. De asemenea au fost realizate teste preliminare de detecție magnetică.
      Pentru determinarea parametrilor de input ai simulărilor numerice, în cadrul proiectului component 4, coordonat de P1 – IMT București, sau realizat experimente de caracterizare a permitivității electrice a celulelor din liniile tumorale THP-1, SW-403 și HT-29, linii tumorale obținute la INCD Cantacuzino, folosind un sistem microfluidic de tipul lab-on-a-chip realizat anterior în cadrul IMT București, dar adaptat pentru determinarea parametrilor input ai simularilor numerice privind celulele tumorale. A fost realizată proiectarea, modelarea și simularea numerică a sistemului dielectroforetic. Am început cu proiectarea unui sistem dielectroforetic simplu, apoi pe măsură ce am obținut parametrii de ieșire din simulările numerice, sistemului i s-au mai adăugat electrozi, sau a fost aleasă altă configurație de electrozi, apoi a fost proiectată tehnologia de realizare și au fost simulate procesele tehnologice individuale pentru realizarea platformei microfluidice.
      Diseminarea rezultatelor s-a realizat prin: 10 - Articole acceptate pentru publicare în reviste indexate ISI sau BDI, 31 - Comunicări științifice susținute la conferințe, seminarii, simpozioane în anul 2018 și 2 cereri de brevet înregistrate la OSIM în aprilie, respectiv iunie 2018.
   Valorificarea resurselor existente la nivelul consortiului s-a realizat astfel: - Valorificarea infrastructurii de cercetare necesare implementării proiectului prin cecuri interne de experiment (1 Cec de tip A1) -       Valorificarea resursei umane prin cecuri de mobilitate la nivelul consorțiului (4 Cecuri de tip B)
      Toate cele 9 poziții vacante au fost ocupate, astfel: 2 asistenți cercetare la TUIASI, un cercetător științific și un asistent cercetare la IMT, 3 asistenți cercetare la INCD Cantacuzino și 2 asistenți de cercetare la UTBv.

      Rezultatele Etapei I
      R1.1 - metodologie de izolare a celulelor tumorale primare din tumori solide optimizat
      R1.2 - formular de consimțământ informat al pacienților si aprobarea studiului de către Comisia de etica
      R1.3 – consimtamintului informat obținut
      R1.4 - linii celulare pentru experimentele preliminare de simulare a dispozitivelor – selectate
      R1.5 – parametri de testare linii celulare tumorale optimizați
      R1.6 - metodologiei de cultivare a celulelor tumorale primare izolate din tumori solide elaborate
      R1.7 – Rezultate diseminare proiect component 1 etapa 1
      R1.8 - Protocol prelevare piese tumorale si piese tumorale
      R1.9 - segmente de filtrare și preprocesare din platforma microfluidică, inclusiv segmentele de injecție probă și regenerare dispozitiv proiectate și simulate
      R1.10 – zonă dielectroforetică pentru concentrarea celulelor de interes și eliminarea celulelor neviabile proiectate și simulate
      R1.11 - microelectrozi interdigitati multiplexati proiectați și simulați
      R1.12 - integrarea electrozilor interdigitati multiplexati in platforma microfluidica
      R1.13 - procese tehnologice individuale pentru realizarea dispozitivului microfluidic. Experimente preliminare
      R1.14 - Rezultate diseminare proiect component 2 etapa 1
      R1.15 - microcanalele sistemului de injectie si a camerei de analiza ce integreaza dispozitivul magnetoforetic si sistemele de detective proiectate și simulate
      R1.16 - dispozitiv magnetoforetic micrometric pentru manipularea si concentrarea celulelor de interes marcate magnetic si eliminarea celulelor neviabile proiectat și simulat
      R1.17 - microsenzor spintronic adaptat detectiei celulelor de interes marcate magnetic imobilizate pe suprafata senzorului
      R1.18 - microsenzor spintronic adaptat detectiei celulelor de interes marcate magnetic folosind metoda relaxarii Browniene; teste comparative
      R1.19 - Diseminarea rezultatelor rezultate proiect component 3 etapa 1
      R1.20 - segmentele de filtrare și preprocesare din platforma microfluidică, inclusiv segmentele de injecție probă și regenerare dispozitiv proiectate și simulate
      R1.21 - zonei dielectroforetice pentru concentrarea celulelor de interes și eliminarea celulelor neviabile simulate și proiectate
      R1.22 – sensor impedimetric proiectat și simulat
      R1.23 – sensor impedimetric integrat
      R1.24 - Diseminarea rezultatelor rezultate proiect component 4 etapa 1
      R1.25 - Cerere de brevet de invenție


     Rezumatul Etapei II
     Toate obiectivele etapei cuprinse în Planurile de activități ale celor patru proiecte componente au fost realizate.
    În această etapă, în cadrul proiectului component 1, coordonat de P2 - INCD Cantacuzino, a fost optimizată metodologia de cultivare a celulelor tumorale primare elaborată în etapa anterioară. Astfel, s-a realizat izolarea și menținerea în cultură pe o perioadă mai mare de 10 luni (aproximativ 10 pasaje) a celulelor tumorale organizate sub formă de sferoizi/agregate celulare provenind de la 2 pacienți cu cancer de colon (cod: T2, T3). În urma folosirii acestei metode s-a observat că organizarea în cultură a celulelelor tumorale T2 s-a făcut sub formă de sferoizi tumorali, iar organizarea în cultură a celulelor tumorale T3 s-a făcut sub formă de agregate multicelulare. Compoziția celulară a structurilor create de cele doua tumori T2 și T3 a fost analizată cu ajutorul microscopiei de fluorescență utilizând markeri epiteliali (EpCAM), markeri pentru celule stem (CD44, CD133, CD166) și markeri de diferențiere caracteristici celulelor epiteliale intestinale (CDX2, citokeratine 4, 5, 6, 8, 10, 13, 18, 20). În final s-au obținut suspensii de celule individuale T2 și T3 care au fost utilizate pentru realizarea activităților ulterioare din această etapă care presupuneau folosirea celulelor tumorale primare.
     În cadrul proiectului 2, coordonat de CO - TUIASI, a fost realizat set-up-ul experimental pentru analiza celulelor tumorale circulante pe bază de spectroscopie dielectrică de bandă largă. Set-up-ul experimental cuprinde bancul de dielectroforeză (DEP) și modulul de spectroscopie dielectrică de bandă largă. Cu ajutorul acestuia s-a determinat spectrul dielectroforetic al liniilor tumorale THP-1 și HT-29, spectrul dielectroforetic al celulelor tumorale izolate din izolate din tumori primare (T2 și T3) și cel al celulelor mononucleare din sânge periferic (PBMC) uman obținute din sângele întreg venos de la un voluntar sănătos. Dielectroforeza și spectroscopia dielectrică de bandă largă au fost realizate pe picături a câte 3μl de celule în suspensie cu concentrația 2x106 celule/ml. Caracteristicile dielectrice analizate cu ajutorul spectroscopie dielectrice de bandă largă au evidențiat modul în care mediul de suspendare (tamponat / netamponat) și conductivitatea acestuia influențează comportamentul celulelor în prezența și absența aplicării gradientului câmpurilor electrice. Diferențele dintre proprietățile dielectrice ale diferitelor celule folosite influențează răspunsul dielectroforetic al celulelor, aceste proprietăți fiind decisive în procesul de sortare a celulelor tumorale de cele sănătoase direct din sânge.
     În cadrul proiectului component 3, coordonat de P3 – UTBv, a fost realizată proiectarea și realizarea unui set-up experimental pentru detecția nanoparticulelor magnetice (NPM) funcționalizate cu PEG6000, folosind senzori magnetorezistivi (MR) realizați din straturi subțiri magnetice de NiFe, detecție bazată pe efectul de magnetorezistență anizotropa (AMR). Având în vedere experiența anterioară în studiul senzorilor magnetici spintronici s-a optat pentru un setup de detecție bazat pe efectul Hall planar (PHE) în care H este aplicat în plan, perpendicular pe axa de ușoară magnetizare, sau după axa de ușoară magnetizare. Setup-ul experimental consta în: (1) sursă de putere bipolară programabilă, (2) sistemul de bobine Helmoltz, (3) sursă de curent programabilă și nanovoltmetru Keithley, (4) 2,5 μl soluție apoasă de maghemită funcționalizată cu PEG6000 pipetată pe suprafața senzorului la t=0 și (5) soluția uscată în câmp magnetic, Hbias=50 Oe, după t=30 min; cip-ul este fixat într-un soclu plasat în centrul bobinelor Helmoltz. S-a arătat că structuri cu arii relativ mari pot, totuși, detecta cantități foarte mici de NPM datorită mecanismului de nucleere a procesului de comutare a magnetizării indus de prezența, pe acesta, a NPM.
     În cadrul proiectului component 4, coordonat de P1 – IMT București, s-a realizat proiectare tehnologică a integrării senzorilor impedimetrici cu microelectrozi interdigitați pe platforma microfluidică, modelare procese tehnologice pentru integrarea senzorilor impedimetrici cu microelectrozi interdigitați pe platforma microfluidică și proiectare tehnologică și simulare de procese tehnologice individuale pentru realizarea dispozitivului microfluidic. Astfel, cu ajutorul software-ului CleWin s-a obținut proiectarea a 4 măști și șase straturi transparente pentru realizarea senzorului impedimetric, al cărui electrod de lucru conține 56 de perechi de interdigiți. Modelarea proceselor tehnologice a fost realizată cu ajutorul software-ului SEMulator3D de la Coventor, program, cu ajutorul căruia au fost generate modele 3D pentru filmele subțiri depuse sau crescute pe substrat de siliciu monocristalin. Simulările numerice 3D ale dispozitivului microfluidic au fost realizate în Comsol 5.4. Astfel, parametrii folosiți în acest studiu sunt: frecvența curentului electric, conductivitatea mediului, a particulelor și a membranelor particulelor, densitatea mediului și a particulelor, vâscozitatea dinamică a mediului, diametrul particulelor, permitivitatea relativă a mediului, a particulelor și a membranelor particulelor precum și grosimea membranei particulelor. Pentru a simula fenomenul de dielectroforeză în Comsol au fost necesare trei module: modulul pentru curgerea laminară, modulul de curent electric și modulul pentru urmărirea particulelor în curgerea fluidului.
     Diseminarea rezultatelor s-a realizat prin: 14- Articole acceptate pentru publicare în reviste indexate ISI sau BDI și 16 - Comunicări științifice susținute la conferințe, seminarii, simpozioane în anul 2019.
     Valorificarea resurselor existente la nivelul consorțiului s-a realizat astfel:
      - Valorificarea infrastructurii de cercetare necesare implementării proiectului prin cecuri interne de experiment (1 Cec de tip A1)
      - Valorificarea resursei umane prin cecuri de mobilitate la nivelul consorțiului (12 Cecuri de tip B)
     Toate cele 9 poziții vacante au fost ocupate, astfel: 2 asistenți cercetare la TUIASI, un cercetător științific și un asistent cercetare la IMT, 3 asistenți cercetare la INCD Cantacuzino și 2 asistenți de cercetare la UTBv.


      Rezultatele Etapei II
      R.1.1. Optimizarea metodologiei de cultivare a celulelor tumorale primare izolate din tumori solide, cu îndepărtarea celulelor normale co-izolate
      R.2.1. Realizare set-up experimental pentru analiza celulelor tumorale circulante pe bază de spectroscopie dielectrică de bandă largă
      R.2.2. Determinarea spectrului dielectroforetic a câtorva linii celulare tumorale
      R.2.3. Determinarea spectrului dielectroforetic a celulelor tumorale izolate din tumori solide
      R.3.1. Proiectare și realizare set-up experimental
      R.3.2. Teste privind detecția în câmp magnetic continuu si alternativ a nanoparticulelor magnetice
      R.4.1. Proiectare tehnologică a integrării senzorilor impedimetrici cu microelectrozi interdigitați pe platforma microfluidică
      R.4.2. Modelare procese tehnologice pentru integrarea senzorilor impedimetrici cu microelectrozi interdigitați pe platforma microfluidică
      R.4.3. Proiectare tehnologică și simulare de procese tehnologice pentru realizarea dispozitivului microfluidic


     Rezumatul Etapei III
     Toate obiectivele etapei cuprinse în Planurile de activități ale celor patru proiecte componente au fost realizate.
     În această etapă, în cadrul proiectului component 1, coordonat de P2 - INCD Cantacuzino, s-a optimizat metodologia de izolare și procedura de cultivare a celulelor tumorale primare pornind de la piese tumorale prelevate de la pacienți. De asemenea, a fost optimizată metodologia de cultivare a unor linii de celule tumorale SW-403 (linie celulară tumorală derivată din adenocarcinomul colorectal) si JURKAT (linie celulara de limfocite T) pentru a facilita optimizarea functionarii platformei microfluidice integrate, folosind linii celulare tumorale.
     În cadrul proiectului 2, coordonat de CO - TUIASI, s-au realizat o serie de teste pentru caracterizarea tehnologică a platformei microfluidice realizate atât pe baza unor teste asupra unor linii celulare consacrate și prin comparație cu alte dispozitive din literatură pentru care au fost furnizate informații cu privire la arhitectură. Testele comparative și rezultatele cu privire la evoluția parametrilor dielectrici au vizat o serie de linii celulare precum THP-1, SW403, JURCAT și celule tumorale izolate din tumori solide T2 și T3. Pentru interpretarea caracteristicilor impedanței electrice ale electrodului interdigitat acoperit cu celule, datele experimentale au fost analizate utilizând un model de circuit electric echivalent simplificat de tip Randles.
     În cadrul proiectului component 3, coordonat de P3 – UTBv, au fost utilizate rezultatele și concluziile desprinse în urma activitatilor desfasurate in etapele anterioare pentru a realiza un dispozitiv experimental ce permite (i) focalizarea nanoparticulelor magnetice (NPM) utilizate pentru marcarea celulelor biologice pe zona de deteție, (ii) detecția atât în DC cât și în AC a NPM cât și (iii) condiționarea semnalelor provenite de la senzorii de măsură și de referință. Au fost efectuate teste în câmp magnetic variabil ce au pus în evidență posibilitatea focalizării NPM deasupra juncțiunii de măsură, stabilitatea termică foarte bună a senzorilor spintronici și a circuitului de condiționare,sensibilități ale semnalului de ieșire mai bune de 16 mV/Oe și obținerea unui semnal a cărui formă de undă este dependentă de prezența NPM deasupra senzorului.
     În cadrul proiectului component 4, coordonat de P1 – IMT București, a fost dezvoltat experimental dispozitivul microfluidic pentru detecția și separarea celulelor tumorale circulante. Dispozitivul este fabricat pe două substraturi: primul substrat conține electrozii din aur interdigitați, iar al doilea substrat este reprezentat de canalul microfludic. Au fost realizate o serie de teste de funcționalitate și s-a realizat o corelare a parametrilor funcționali cu tehnicile clasice de analiză și cu platformele microfluidice cu senzor cu electrozi interdigitați multiplexați integrat și respectiv dispozitivul magnetoforetic.
     Diseminarea rezultatelor s-a realizat prin: 5 - Articole acceptate pentru publicare în reviste indexate ISI sau BDI, 9 - Comunicări științifice susținute la conferințe, seminarii, simpozioane în anul 2020.
     Valorificarea resurselor existente la nivelul consortiului s-a realizat astfel:
     -  Valorificarea resursei umane prin cecuri de mobilitate la nivelul consorțiului (1 Cec de tip B)
     Toate cele 9 poziții vacante au fost ocupate, astfel: 2 asistenți cercetare la TUIASI, un cercetător științific și un asistent cercetare la IMT, 3 asistenți cercetare la INCD Cantacuzino și 2 asistenți de cercetare la UTBv.


      Rezultatele Etapei III
      R.1.1.Optimizarea funcționării platformei microfluidice integrate, folosind linii celulare tumorale
      R.1.2. Optimizarea metodologiei de izolare a celulelor tumorale primare din tumori solide       R.1.3. Optimizarea metodologiei de cultivare a celulelor tumorale primare izolate din tumori solide
      R.2.1. Diferențierea celulelor tumorale de cele sănătoase prin spectroscopia dielectrică de bandă largă
      R.2.2. Determinarea frecvențele specifice DEP utilizate pentru sortarea celulelor tumorale circulante
      R.2.3. Compararea platformei microfluidice obținute cu cele raportate în literatura de specialitate
      R.3.1. Proiectare și realizare set-up experimental
      R.3.2. Teste privind detecția în câmp magnetic continuu si alternativ a nanoparticulelor magnetice
      R.4.1. Fabricarea dispozitivului dielectroforetic
      R.4.2. Simularea numerică a sistemului dielectroforetic


      Raport Științific Tehnic 1: http://ucelldetect.ro/rapoarte/

      Raport Științific Tehnic 2: http://ucelldetect.ro/rapoarte/

      Raport Științific Tehnic 3: http://ucelldetect.ro/rapoarte/